Информационная РНК в липидных наночастицах спасает клетки HEK 293 от липидов

Том 12 научных отчетов, номер статьи: 22293 (2022) Цитировать эту статью

2220 Доступов

5 Альтметрика

Подробности о метриках

Аналитические инструменты для изучения физиологии клеток имеют решающее значение для оптимизации взаимодействия лекарственного средства с хозяином. Импульсная ЯМР-спектроскопия в реальном времени, RTPC-ЯМР, была внедрена для мониторинга кинетики продукции метаболитов в клетках HEK 293T, обработанных вакциноподобными липидными наночастицами, LNP, с мРНК и без нее. Параметры кинетического потока определяли для включения изотопной метки в метаболиты и выведения меченых метаболитов из клеток. Изменение характерного времени продукции аланина связано с дисфункцией митохондрий вследствие обработки клеток липидными наночастицами (ЛНЧ). Митохондриальная дисфункция в значительной степени уменьшалась за счет включения мРНК в ЛНЧ, присутствие которой увеличивало размер и однородность ЛНЧ. Методика применима ко всем культивируемым клеткам.

Замечательный успех вакцин на основе липидных наночастиц мРНК, модифицированных псевдоуридином, на основе LNP, против COVID-19, которые используют врожденный механизм трансляции, приводимый в действие клеточным метаболизмом, выводит эту технологию на передний план медицины1,2,3,4,5,6 . Были протестированы многие потенциальные применения мРНК ЛНЧ для лечения хронических заболеваний, таких как диабет7,8,9, рак и генетические нарушения10,11. Терапия на основе информационной РНК использует сложный набор биологических молекул, которые необходимо оптимизировать для каждого применения. Могут ли эти клетки конкурировать с окружающими клетками за дефицитные ресурсы питательных веществ в живых тканях? Как долго будет продолжаться эффективное производство генных продуктов мРНК? Будет ли деградация мРНК ЛНЧ, которая высвобождает метил псевдоуридин, ингибировать транскрипцию? Будут ли липиды, составляющие ЛНЧ, повреждать плазму и внутренние клеточные мембраны? Эти проблемы имеют решающее значение и должны быть решены для облегчения реализации терапии.

Динамический ответ клеток на лекарственное лечение можно оценить с помощью метаболического профилирования, которое обычно выполняется с помощью масс-спектроскопии или ЯМР-спектроскопии12,13. Методика обычно требует лизиса и экстракции клеток для определения общих концентраций метаболитов, обеспечивая снимки клеточной физиологии в течение периода от часов до дней, что по своей сути является предвзятым из-за многоэтапных процессов, необходимых для подготовки образцов12,13. Инвазивная методология нарушает компартментарную структуру метаболических сетей и может не отражать реактивные процессы, происходящие после применения вакцины на основе ЛНП. ЯМР-спектроскопия в реальном времени использует анализ природного содержания 13C или анализ на основе индикаторов для идентификации метаболитов путем сбора спектров 1H, отредактированных изотопом 13C, из клеток, что позволяет быстро собирать данные и тем самым увеличивать временное разрешение экспериментов до 10 минут или меньше14,15.

В более поздних метаболомических исследованиях на основе ЯМР в реальном времени используется биореактор для поддержания клеток в физиологически активном состоянии и может обнаруживаться свободные внутриклеточные метаболиты, но отсутствует возможность отслеживать ключевые реакции, такие как гликолиз, которые происходят в течение минут16,17,18 . Внедрение импульсной ЯМР-спектроскопии в реальном времени, RTPC-ЯМР, сочетает в себе использование 13C-глюкозы и 13C-отредактированного протонного ЯМР со сверхчувствительным криозондом ЯМР19 и улучшенной конструкцией биореактора20 для увеличения временного разрешения экспериментов до 47 с. позволяя отслеживать быстрые изменения метаболических потоков в ответ на стимулы. Метаболиты, меченные 13С, наблюдаются на немеченом фоне. Этот метод представляет собой передовую технологию анализа здоровья клеток путем объективного отслеживания динамики включения углерода 13C и выявления того, как стимулы влияют на метаболические пути.

Модифицированную мРНК люциферазы, содержащую N1-метилпсевдуридин вместо уридина, получали методом транскрипции in vitro на основе ранее опубликованного протокола21,22 и использовали для всех экспериментов. Включение N1-метилпсевдуридина повышает стабильность мРНК и усиливает экспрессию белка в клетках млекопитающих22,23. Очищенный транскрипт включал ~150-нуклеотидный 3'-поли(А)-хвост и 5'-Cap124 для дальнейшего облегчения трансляции белка (дополнительная фигура 1). Модифицированную мРНК трансфицировали в клетки HEK 293T в течение 24 часов с использованием пяти реагентов для трансфекции (рис. 1а, дополнительная таблица 1). Клетки HEK 293T ранее использовались для мониторинга поглощения и экспрессии мРНК люциферазы21,22. В соответствии с Карико и др.21,22, только один реагент, Липофектамин 2000, LF, доставлял достаточное количество мРНК в клетки для генерации люминесцентно-зависимого сигнала люминесценции.